呼气挥发性有机物检测在癌症诊断中的应用

1  人体呼气中 VOC 来源VOC广泛存在于外界大气中。各种人类的生活生产过程，如食品、钢铁、石油化工等生产过程，机动车排放尾气，voc浓度   室内装潢家具以及自然界一切动植物的生命活动都是大气中 VOC 的重要来源。 人体呼气中的VOC有两个主要来源：外源性和内源性 VOC。外源性 VOC 可产生于人类生产活动、自然植物释放等多种过程，它们通过人体呼吸进入人体或直接通过皮肤吸收。内源性 VOC 可产生于人体内多种不同的生化反应过程中，如维持细胞膜完整性、能量代谢、氧化应激等各种基本细胞功能均与 VOC 产生有关。目前认为，氧化应激可能是内源性 VOC 产生的主要过程。 2  人体内 VOC 的代谢 2.1 通过细胞色素 P450 氧化酶系统代谢 在人体某些生理或病理状态下细胞色素 P450 氧化酶系统可有不同程度的增强或抑制，此时人呼气中VOC 也出现变化，如有研究显示在部分肺癌患者体内细胞色素 P450 系统激活，引起 VOC 的降解加速，可导致呼气中成分的改变。 2.2 通过肺呼出 VOC 可以在全身各种细胞中产生，由于其在水中溶解度极低，可以通过血流到达肺泡，并通过呼气排出体外。因此，呼气中内源性 VOC 认为主要来源于肺泡。 3  VOC 的检测方法 由于 VOC 在呼气中的浓度极低，需要应用特殊的样本前处理技术及敏感性极高的仪器对其进行检测。目前比较常用的仪器有气相色谱，质谱联用仪（gas chromatography/mass spectrometry，GC-MS）、质子转移反应质谱仪（proton transfer reaction mass-mass spectrometry，PTR-MS）及电子鼻传感器等。 GC-MS 是一种将气相色谱仪经接口与质谱计结合而构成的气相色谱一质谱法的分析仪器。VOC 通过 GC 时会有各自的保留时间，通过 MS 时会形成特征性的碎片离子，两者数据结合再与数据库中已知物质进行比对，就可以确定 VOC 的种类。voc监测系统   GC-MS 在VOC 分析中应用存在不少不足之处，如分析周期长、精确定量较难等。除此以外，检测样品需要预浓缩处理，常用的方法有固相微萃取（solid phase microex-traction，SPME）等。 PTR-MS 采用“软”电离方法——质子传递反应，利用被测物质子亲和能高于水而低于高聚水的性质使物质电离，使多种 VOC 能与 H3O+ 进行反应 VOC+H3O+→[VOCs+H]++H2O，产生分子离子，之后通过获得分子量信息，对混合物成分定性定量。它具有无需预处理过程、测量时不形成碎片离子、检测速度快、灵敏度高等优点，而且是绝对量测定，不需要标定。但 PTR-MS 无法明确 VOC 种类，制约了在 VOC 检测中的应用。 电子鼻是一种利用气体传感器阵列的响应图案来识别气味的电子系统，它通过传感器阵列与不同气味分子（包括 VOC）发生作用，产生不同的响应谱来对气体进行分析。电子鼻具有高敏感、便携及易操作等诸多优点。然而，高湿度及某单一物质极高浓度均会影响到电子鼻的敏感性，无法提供绝对校准，一些传感器原件相对低寿命，无法提供计量资料，这些都影响到电子鼻在实际临床工作中的应用。 4  人呼气中 VOC 检测与肺癌 早在 20 世纪 70 年代，Pauling 等便在人呼气中检测到 200 多种 VOC 成分，接着，逐渐发现其中的一些成分与不同的病理状态有关。之后不少研究者用改进的方法对人呼气中的 VOC 进行检测，结果都显示呼气中的烷烃等 VOC 与肺癌相关。他们筛选出多种 VOC 构建出不同的肺癌诊断模型，可达到较好的敏感度和特异度。 近几年，人们对呼气 VOC 的研究从单纯的临床研究转移到组织甚至细胞水平，不断尝试新的方法对呼气 VOC 进行检测，并对可能影响到肺癌诊断的其他因素（如炎症或其他肿瘤等）进行探讨，也开始对肺癌患者癌肿切除术后呼气 VOC 变化进行长期的随访研究。 Chen 等从多位肺癌患者体内取得的肺癌细胞进行培养，并应用 SPME-GC 方法对其培养瓶顶空气体进行 VOC 检测，同时对这些肺癌患者呼气中 VOC 进行检测，得到 11 种肺癌特征性的 VOC，其中有一部分与肿瘤细胞培养时顶空气体所测的 VOC 相同。Poli 等应用 SPME-GC-MS 方法，发现非小细胞肺癌患者手术切除 3 年后，呼气中异戊二烯及苯的浓度下降，戊烷、甲苯及乙苯的浓度上升。在肺癌组织 VOC 分析中发现，除了二甲苯以外，癌组织散发出的其他所有芳香烃浓度皆高于正常组织。最终研究者认为呼气 VOC 分析不仅可用于肺癌患者诊断，在其术后随访中也具有一定意义。Dragonieri 等研究发现肺癌患者“呼气指纹”可与慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者的相区别。Barash 等应用基于金纳米颗粒传感器阵列的电子鼻对非小细胞肺癌患者呼气进行检测，与正常对照比较准确率达到了 100%。2010 年 D'Amico 等应用电子鼻对肺癌、其他肺部疾病（包括 COPD、间质肺疾病、胸膜炎、支气管炎）、正常对照的呼气 VOC 进行检测并综合分析，总体诊断肺癌的敏感性大于 80%，其中与正常对照比较敏感性为 85%，与其他肺部疾病比较敏感性为 92.8%，而 3 组综合比较敏感性为 89.3%。 近些年来，人们也开始尝试应用 PTR-MS 方法对肺癌患者进行检测。Wehinger 等发现质荷比为 31（考虑为甲醛）和 43（考虑为质子化后异丙醇的一个片段）的 VOC 在肺癌患者呼气 VOC 中显著升高。2009 年 Bajtarevic 等用 PTR-MS 及 SPME-GC-MS 两种不同的方法，分别对肺癌、正常成人呼气中 VOC 水平进行检测。PTR-MS 检测结果显示与正常对照比较，异戊二烯、丙酮、甲醇的含量有轻度减少。SPME-GC-MS 则在两组之间发现 50 多种不同 VOC，从中选取特定 4 种、15 种、21 种 VOC 建立肺癌诊断模型，敏感性分别为 52%、71%、80%，特异性皆为 100%。Bajtarevic 等还就吸烟对呼气中 VOC 影响进行研究，发现吸烟的确会影响呼气中 VOC 的种类和水平，如乙腈几乎存在于所有吸烟患者中，而在非吸烟患者中含量极低，可以作为一种吸烟相关的 VOC。 5  呼气 VOC 检测与其他肿瘤 Phillips 等将 GC-MS 技术用于乳腺癌的诊断，敏感性和特异性分别为 93.8% 和 84.6%。Qin 等又应用 SPME-GC-MS 检测肝癌患者呼气，发现 3- 羟基 -2- 丁酮、苯乙烯、癸烷可以作为肝癌潜在的标志物，其中 3- 羟基 -2- 丁酮被认为最有诊断价值。这些标志物诊断肝癌的敏感性和特异性可分别达到 86.7% 和 91.7%。de Gennaro 等实验证明 GC-MS 呼气分析可用于恶性间皮瘤患者和长期石棉暴露、正常对照两组人群的鉴别，并认为环戊烷可能是进行鉴别的重要化合物。Silvano Dragonieri 等用电子鼻也得出了相似结果。 更值得注意的是，当 Peng 等将金纳米颗粒传感器阵列电子鼻应用到肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌及正常对照组在呼气的鉴别中时，发现这种电子鼻不仅可以区分癌与非癌，还可以将不同癌症很好的区分开来。他们还应用 SPME-GC-MS 进行相同实验，发现虽然与正常对照比较时，各种癌症都具有各自独特的 VOC 谱，但在综合分析时，SPME-GC-MS 却无法将各种癌症区分开来。接着同一研究团队又应用同一电子鼻鉴别良性乳腺疾病与乳腺癌，也获得了较为满意的结果。研究成果使人们看到了呼气分析，特别是电子鼻，在全身多种癌症诊断方面的巨大潜力和广阔前景。 6  呼气分析中存在的问题 6.1 肿瘤患者呼气中 VOC 成分变化的机制不明 目前，人们对于各种内源性 VOC 的产生机制仍不甚清楚，因此对于在某些疾病或应激状态下人体呼气中 VOC 成分变化的机制也一直存在争论。 Poli 等对非小细胞肺癌患者手术后的随访发现，癌肿切除短期内对呼气中 VOC 影响不大，故 Poli 提出肺癌患者呼气中 VOC 可能并不来自或仅仅小部分来自肿瘤组织，不能作为肺癌的标志物，而其变化也仅仅是肺癌的伴随症状。而之前 Di Natale 等应用基于石英微天平传感器系统的电子鼻对肺癌患者、肺癌术后患者及正常对照的呼气进行检测，发现 56% 的肺癌术后患者被划分为正常对照组，而另外 44% 也不与肺癌组重叠，被单独划为肺癌术后组，故认为应用电子鼻所测得的呼气中 VOC 的变化直接来源于肺癌细胞本身。Chen 等用 SPME-GC 方法对肺癌患者呼气进行检测，得到 11 种肺癌特征性的 VOC，其中有一部分与相应肺癌细胞株顶空气体所测的 VOC 相同。故研究者认为肺癌患者呼气 VOC 的改变一部分源自肺癌细胞本身，而另一部分可能源自肿瘤微环境的巨大变化，如氧化应激造成。之后人们又发现，虽然肺癌呵导致局部氧化应激反应加强，但与 COPD 等其他引起氧化应激的肺部疾病比较，呼气中 VOC 的改变并不相同。对于各种引起氧化应激的非肿瘤疾病，其所测得的呼气中 VOC 改变也不尽相同。 因此，呼气中 VOC 成分的改变机制目前仍不清楚，很可能是一个多因素影响的复杂过程，仍需要进一步的探索。 6.2 各种呼气分析仪器的局限性 GC-MS 可对呼气中 VOC 进行定性定量，在呼气分析中较为常用。但由于 GC-MS 本身仅能对 ppm 级的化合物进行检测，这远远不能达到对呼气中 VOC 检测的要求（常为 ppb 级），因此需对呼气中 VOC 进行预浓缩处理。SPME 是一种常用的预浓缩方法，但它对不同 VOC 的浓缩程度不同，能够选择性加强一些 VOC 信号，同时减弱另外一些 VOC 信号，最终对分析结果产生影响。而 PTR-MS 和电子鼻虽然无需进行预浓缩处理，检测方便、高效，但 PTR-MS 不能对所检测 VOC 定性，电子鼻只能得到特定“呼气指纹”，无法对 VOC 定性定量，且人们对电子鼻鉴别呼气的明确机制仍有争议。 6.3 呼气采集方法对实验结果的影响 呼吸道死腔可对呼气 VOC 检测产生影响。人体内源性 VOC 通过肺泡毛细血管膜进入肺泡气体中，因此直接测定肺泡气体中的 VOC 可能更具有价值。而呼吸道死腔气体会影响肺泡气体的采集，因此通过呼气采集器将死腔气体排除，直接采集肺泡气体，应可增加结果的准确性。Miekisch 等研究较好揭示了混入呼吸道死腔气体对呼气分析最终结果产生的影响。除此以外，呼气采集前呼吸的深度、是否剧烈运动以及呼气采集时呼气流速均可能对呼气中 VOC 的检测结果产生影响。